Nucleic Acids Research | circSamd4抑制PUR蛋白的成肌转录活性

通过与蛋白质和核酸的相互作用，circRNA家族会影响许多生物学过程。在2020年1月25日，美国国立卫生研究院国立衰老院内研究计划研究所遗传与基因组学实验室Poonam R. Pandey等研究人员在Nucleic Acids Research杂志上发表了一篇关于成肌机制的文章，介绍了circSamd4在人和小鼠的成肌过程所起到的影响[1]。

太长不看版：

● 在分化为肌管的小鼠C2C12成肌细胞中，circSamd4的表达显著增加；

● 干扰circSamd4之后可延缓培养的成肌细胞的成肌作用，并降低成肌标记物的表达；

● 肌球蛋白家族的肌球蛋白重链（myosin heavy chain, MHC）的两个抑制因子PURA和PURB蛋白能够抑制MHC转录，而circSamd4与PURA和PURB存在相关作用，circSamd4会通过和这两个PUR蛋白的结合来减轻这种抑制，从而增强了肌发生。

认真阅读版：

作者是如何发现circSamd4在成肌细胞分化中所起的作用的？如何通过这个机制影响成肌过程？

如何发现circSamd4在成肌细胞分化中所起的作用的？

作者使用了小鼠C2C12成肌细胞的成肌模型来研究简化的骨骼肌分化过程中circRNA的作用。为了鉴定在成肌过程中差异表达的circRNA，将分别在正常生长培养基（GM）和分化培养基（DM）中培养3天的C2C12细胞提取其总RNA并通过 RNA-Seq鉴定circRNA（GSE92632和GSE136004），选取了分化过程中高度富集的circSamd4（circbase ID：mmu_ circ_0000529，has_circ_0004846）来做进一步的研究。

为了检测这种肌生成模型，作者研究了肌生成标记物MEF2C和MYOG的表达水平，它们在转录上调节了肌生成蛋白的表达程序。然后进行qPCR检测这些成肌标记物以及肌源性蛋白肌球蛋白重链（MHC）的表达水平，结果发现在分化过程中相对于的GM培养的C2C12细胞，DM培养的C2C12细胞中这些标记物相应的mRNA表达水平显著提高。

图1 circRNA在成肌过程中的差异表达

circSamd4的表征如何？

作者使用RNase R降解线性RNA后几乎消化掉了所有Samd4 mRNA，但没有消化掉circSamd4，证明了circSamd4的环状性质。尽管在成肌过程中circSamd4的表达水平增加了约14倍，但Samd4 mRNA的表达水平仅增加了3倍，这表明在成肌过程中circSamd4表达会被选择性上调。而通过使用qPCR和单分子原位杂交技术，发现circSamd4表达水平总体上随着分化而显著增加，并且在细胞质和细胞核中均能发现，但主要存在于细胞质中。

图2 circSamd4的表征

circSamd4促进肌发生

为了探讨circSamd4在成肌细胞分化中的生物学功能，作者设计了针对circSamd4的siRNA进行干扰。首先，显微镜分析表明干扰circSamd4之后可以延缓肌管形成，肌生成标记肌酸激酶（CK）的活性水平以及成肌标记Myog、Mef2和MHC mRNA的表达水平也随之下降。然后免疫荧光分析证明干扰circSAMD4后，成肌过程中人类成肌细胞中成肌标记物MHC也随之减少。接着Western blot分析表明，在干扰circSAMD4后，分化的成肌细胞中的MHC和其他成肌标记物（MYOG，MEF2C）也会降低。而在C2C12细胞中过表达circSAMD4之后，MHC mRNA的表达水平也会上升。这些结果表明circSamd4促进了肌发生。

图3 干扰circSamd4可降低成肌标记物的水平

circSamd4与MHC生产的转录阻遏物PURA和PURB有何相关性？

为了研究circSamd4是如何调节肌发生的，作者试图确定与其相互作用的相关蛋白。首先，作者设计了一个与跨circSamd4环化位点区域互补的反义寡聚体（ASO）进行pulldown富集circRNA，然后进行质谱分析鉴定了相关蛋白，发现小鼠成肌细胞中约380种可能有相互作用的蛋白，人成肌细胞中约有75种可能有相互作用的蛋白，进一步的GO分析和表型聚类分析发现共有53种蛋白质在RNA加工中起关键作用。

在这些共有的蛋白质中，选取了肽段数量最大并在肌发生或骨骼肌代谢中发挥潜在作用的PURA和PURB作为两个候选蛋白。这些蛋白质特别有趣，因为先前的报道表明，能结合RNA/DNA的PURA和PURB具有与C2C12细胞中MHC启动子的近端启动子结合并对MHC产生负调控的功能。接着作者使用ASO进行了pulldown和WB检测发现分化条件下PURA和PURB蛋白也随之增加。如果复合物用RNase A消化，则PURA和PURB将不再存在，但在用RNase R消化后，它们仍保留在复合物中，这支持了它们与circSamd4相关的观点。最后RIP结果则显示circSamd4与PURA和PURB能发生特异性结合。

图4 circSamd4与转录因子PURA和PURB相互作用

circSamd4中究竟是否存在特定区域能与PUR蛋白发生有效结合？

为了了解circSamd4和PUR蛋白之间相互作用的区域，作者先制备了跨越circRNA主体的非重叠生物素化RNA片段，然后进行pulldown和WB分析发现这两种蛋白与片段3的结合最为紧密。再通过使用过表达全长circSamd4或缺少片段3的截短的circSamd4Δ3的载体获得了内源性PUR蛋白结合片段3的证据。然后RIP分析发现仅全长circSamd4在PURA和PURB IP样品中富集，而截短的circSamd4Δ3并未发生富集，并且无论全长或截短的circRNA是否过表达，PUR蛋白与线性Samd4 mRNA的相互作用都不会改变，则进一步支持了PURA和PURB与circSamd4的片段3相关的观点。接着通过在HeLa细胞中过表达这些质粒以及空载体pcDNA3，然后进行ASO pulldown分析发现与过表达circSamd4Δ3的培养物相比，过表达全长circSamd4的培养物中PURA和PURB的含量都更高，表明该片段对于蛋白质结合非常重要。

以上这些数据表明，circSamd4中的片段3对于有效结合PURA和PURB非常重要。

图5 PUR蛋白主要与circSamd4的特定区域相关

PURA和PURB能抑制MHC mRNA的转录，而circSamd4是否减轻了这种抑制？

PUR蛋白可以促进靶基因的转录，但它们也可以抑制转录，如MHC蛋白。qPCR和WB分析发现干扰C2C12成肌细胞中的PURA或PURB会导致MHC RNA和MHC蛋白的表达量增加。而荧光素酶报告基因实验发现干扰PURA或PURB后显著提高了MHC驱动的荧光素酶表达，证明了PURA和PURB抑制MHC表达的观点。然后，作者假设circSamd4的结合可能会影响PURA和PURB功能，在全长circSamd4或circSamd4Δ3存在的情况下使用了荧光素酶报道基因载体，实验发现仅全长circSamd4的表达能够在分化的C2C12培养物中促进报告基因的表达，而缺失突变体的circSamd4Δ3或空载体对照的表达则未发生变化。此外，circSamd4的表达增加了C2C12细胞中MHC的表达，而circSamd4Δ3的表达则不会。这些数据表明，circSamd4可能螯合PURA和PURB蛋白，从而在成肌过程中使MHC产生，而缺失突变体circSamd4Δ3由于无法与PURA和PURB结合而不能抑制MHC的产生。

为了直接测试这些可能性，作者还评估了circSamd4是否影响PUR蛋白与MHC启动子的结合。首先，进行了染色质免疫沉淀（ChIP）分析以及对保守的MHC近端启动子区域进行qPCR分析，该分析揭示了在DM条件下，耗尽了C2C12细胞中的circSamd4之后PURA和PURB与MHC启动子的结合显著增加，支持了circSamd4可以减轻PURA和PURB对MHC转录抑制的观点。相反，在C2C12细胞中circSamd4的过表达则具有相反的作用。

总的来说，这些数据支持了一种模型，即在正常培养条件下的成肌细胞中，PURA和PURB抑制了MHC启动子和MHC的产生。

图6 PUR蛋白通过转录抑制MHC的产生

图7 circSamd4与PUR蛋白结合，抑制Mhc基因转录

最后，我们再来个小结

越来越多的研究认为circRNA与影响发育和疾病的基因调控网络有关。作者研究了circSamd4在成肌细胞分化为肌管的过程中所起到的作用，发现circSamd4的表达在骨骼肌分化过程中显著增强，并与PURA和PURB蛋白存在相关作用，这两种蛋白能结合并转录抑制MHC启动子，从而抑制肌源性分化，而circSamd4与这两种蛋白的结合则减轻了这种抑制，从而间接促进了肌发生。

该研究对于了解肌发生的过程具有一些参考意义，由于几种慢性骨骼肌功能障碍与MHC产生的变化有关，因此调节circSamd4功能的干预措施可能在疾病中具有治疗价值。

参考文献

1.Poonam R Pandey, et.al., circSamd4 represses myogenic transcriptional activity of PUR proteins, Nucleic Acids Research, 2020.

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